技术文档

当前位置:

SnapGene怎样进行引物设计

什么是引物(Primers)?



引物是聚合酶链反应(PCR)技术中使用的短单链DNA序列。在PCR方法中,使用一对引物与样品DNA杂交并确定将被扩增的DNA区域。引物也被称为寡核苷酸(Oligonucleotides)。



引物具备哪些特性?

引物的主要特性是需要与模板分子上的序列相对应(需要与模板链互补)。


引物有长短之分。短引物主要用于扩增小而简单的DNA片段,而长引物用于扩增真核基因组DNA样本。引物不宜过长(>30-mer primers)或过短。过短的引物会产生不准确的非特异性DNA扩增产物,过长的引物会导致杂交速率降低。平均而言,需要扩增的DNA片段大小应该在1-10KB以内。


引物结构要相对简单,不含内部二级结构,避免内部折叠。同时,还需要避免“Primer-Primer”退火(Annealing),这种退火会产生引物二聚体(primer dimers)并破坏扩增过程。设计时,如果不确定要在引物的某个位置放置什么核苷酸(nucleotide),可以在该位置包括多个核苷酸,称为混合位点(mixed site)。也可以使用基于核苷酸的分子插入物(肌苷,inosine)来代替常规核苷酸,以实现更广泛的配对能力。


<总结>


  • 18-24个碱基的长度;

  • G/C含量在40-60%

  • 起止于1-2G/C对;

  • 熔化温度(Tm)为50-60℃;

  • 引物对之间的Tm应在5℃之内;

  • 引物对不应该有互补区域。


Step 1 粘贴引物序列



点击Primers→Add Primer...然后复制粘贴序列。


Step 2 选择绑定位点(可选)



或者,可以从在序列上选择所需的绑定站点开始。点击鼠标并拖动以进行选择,相应引物的熔化温度就会显示出来。在所选位置添加引物,Primers→Add Primer。


Step 3 选定底链或顶链(可选)



若引物是从选定的结合位点制成的,需要指定是选择Top Strand还是Bottom Strand。


Step 4 引物命名



如有需要,可以为引物命名,方便后续管理。


Step 5 输入描述



如有需要,可以输入详细描述。Description页签是默认打开的。


Step 6 修改引物


如需要,可以修改引物以增加一个5'扩展或引入突变。SnapGene提供两种方法:



一种是在文本框中手动编辑引物序列;



另一种是在变更位置单击引物序列,然后单击Insertions选项卡。使用对话框控件添加所需的密码子、限制位点、或肽编码序列。


Step 7 查看结合部位和熔化温度



结合位点的数目和计算的熔化温度显示在窗口的底部。点击对话框右下角的蓝色文本,可以看到熔化温度计算方法的总结。


Step 8 查看引物



点击Add Primer to Template可以查看新的引物。


Step 9 选择多个引物



如要批量编辑多个引物,先选中目标引物。打开Edit Primers对话框,点击Primers→Edit Primers。


Step 10 确认改动点



如上图选择想要修改的引物颜色、磷酸化、和字体、然后点击OK。


Step 11 查看更新的引物



可以看到更新后的引物,如上面序列视图举例,引物的颜色被更改为红色。



而在上面Map视图中,可以看到更新颜色后的引物有圆点标记。





查看SnapGene软件详情

从GMS中为MODLFOW-NWT使用UPW包
从 Surfer 中的数字高程模型创建地形坡度图

2022-06-20

上一篇:

下一篇:

分享到: 0